Als Verteidiger des katholischen Glaubens konzentrierten sich die Habsburger auf Religionskriege gegen die Protestanten. Zur gleichen Zeit, als im Reich Krieg geführt wurde, in den Jahren 1546-1547, erhoben sich die böhmischen Stände auch gegen Ferdinand. Der Aufstand wurde jedoch von den benachbarten Länder des böhmischen Staates nicht unterstützt. Das Schicksal des Widerstands wurde im Anschluss an die Niederlage des Hauptverbündeten, des Herzogs von Sachsen, entschieden. Die königlichen Städte wurden am meisten bestraft.
Die Religionskriege im Reich endeten nicht mit dem Sieg der katholischen Seite. Mit dem steinernen Grundsatz "cuis regio, eius religio" ("Wessen Gebiet, dessen Religion"), wurde mit dem Frieden von Augsburg 1555 das protestantische Glaubensbekenntnis legalisiert. Religion wurde durch den Glauben des Herrschers bestimmt, und die Bevölkerung musste ihm in diesem Glauben folgen. Das bedeutete eine Niederlage für die Habsburger, die um ein katholisches Reich gekämpft hatten.
1556 trat Karl V. zurück, und Ferdinand I. wurde Kaiser. Der Frieden von Augsburg galt im Königreich Böhmen jedoch nicht. Neben den Prager Kompaktaten, die die Kirchen der Katholiken und Ultraquisten zuließ, übten die Lutheraner und die Böhmischen Brüder ihren Glauben im Reich unerlaubterweise aus. Auf dem Konzil von Trient erklärte die katholische Kirche ihr Ziel der Rekatholisierung und der Wiederherstellung ihres ursprünglichen Status.
1561 wurde der Posten des Erzbischofs von Prag zum ersten Mal seit der hussitischen Ära durch Brus von Müglitz besetzt. Die böhmischen Lutheraner, die Ultraquisten, und die Böhmischen Brüder einigten sich auf das protestantische Glaubensbekenntnis in der so genannten Böhmischen Konfession. Diese sollte die Religionsfreiheit sichern und gestand nichtkatholischen Kirchen ihre eigene Verwaltung zu. 1575 legten sie die böhmische Konfession Maximilian II. (1564-1576) vor. Der Souverän hatte nicht viel Raum für Manöver in einer Situation, wo er den Reichstag dazu benötigte, eine neue Steuer und die Wahl seines Sohns Rudolf als König von Böhmen zu verabschieden. Trotzdem erkannte er die böhmische Konfession nur mündlich ohne bindende Kraft an, doch er bestätigte sie niemals schriftlich.
Indem er den Hof von Wien nach Prag verlegte, brachte Kaiser Rudolf II. (1576-1611) für einige Zeit den Glanz der Hauptstadt nach Prag zurück. Böhmen wurde das Zentrum seines Reiches. Rudolf wurde in erster Linie berühmt als Schutzherr, Sammler und Förderer der Astronomie, Alchimie und Astrologie. Aber er war auch bekannt als ein Exzentriker, dessen Zustand zwischen Tobsuchtsanfällen und tiefer Teilnahmslosigkeit wechselte. Rudolfs Reich war von den Türken bedroht.. Ungarische Magnaten nutzten diese Situation aus und traten in eine Allianz mit ihnen gegen die Habsburger ein. Nach einer der Niederlagen, die folgten, gewannen die Ungarn durch den Wiener Vertrag politische und religiöse Freiheit. Ungeachtet der Tatsache, dass Rudolf besiegt war, weigerte er sich, den Vertrag zu unterzeichnen oder dessen Gültigkeit anzuerkennen.
Schließlich wurde dies von seinem Bruder, Kaiser Matthias, getan. Der kränkliche Rudolf verdächtigte seinen Brudersystematisch, auf den Thron aus zu sein, und das ist es, was schließlich geschah. Indem er den Wiener Vertrag boykottierte , brachte Rudolf seinen Bruder Matthias sowie die Ungarn, Österreicher und die mährischen Stände gegen sich auf. Sie alle rebellierten 1608 gegen ihn. Jedoch erhoben sich die Vertreter der böhmischen Stände nicht auf der Seite der Rebellen, und so musste Matthias mit seinem Bruder zu einer Übereinkunft kommen. Rudolf II. wurde gezwungen, den Frieden von Wien anzuerkennen und die Regierung Ungarns, Mährens und der österreichischen Länder Matthias zu übergeben. Er behielt Böhmen, Ober- und Niederschlesien. Die böhmischen Stände nutzten die sehr schwache Position des Monarchen geschickt aus und drohten ihm mit dem Ausbruch einer Rebellion.
Am 9. Juli 1609 zog Rudolf II es vor, seinen berühmten Majestätsbrief herauszugeben, in dem er feststellte, dass niemand zum Katholizismus oder zu irgendeinem anderen Glauben gezwungen werden konnte. Er bestätigte die böhmische Konfession von 1575 und nahm Bezug auf den Adel, die königlichen Städte und Leibeigenen. Er sicherte Religionsfreiheit zu, unabhängig vom Status der Person. Dreißig Verteidiger des Glaubens wurden gewählt, 10 aus jedem Stand - dem Adel, der Ritterschaft und der Städte. Um seinen gehassten Bruder von seiner Nachfolge auszuschließen, versuchte der unzufriedene Rudolf, die Situation umzukehren. Er nutzte die Hilfe seines Verwandten, dem Bischof von Passau, und ließ die Passauer Streitkräfte in Böhmen einfallen. Natürlich erntete dies nur Missbilligung und Empörung im Land. Er wurde auch gezwungen, den böhmischen Thron frei zu machen, der dann von Matthias eingenommen wurde (welcher von 1611 bis 1619 herrschte).