Les Habsbourg, défenseurs de la foi catholique, se concentraient sur les guerres de religion contre les protestants . Alors que ces guerres battaient leur plein dans l'empire, les Pays tchèques se révoltèrent contre Ferdinand dans les années 1546–1547. Cependant, cette révolte ne fut pas soutenue par les pays voisins et, la défaite du principal allié, le duc de Saxe, scella le destin de la révolte. Ce sont les villes royales qui en payèrent le prix fort.
Les guerres de religion ne prirent pas fin après la victoire des catholiques. En déclarant le principe du "cuius regio, eius religio" (tel prince, telle religion), la paix d'Augsbourg , signée en 1555, légalisait la foi protestante. La foi du souverain déterminait la religion, et les sujets devaient suivre. Cet événement signa la défaite des Habsbourg qui luttaient pour un empire catholique.
En 1556, Charles V abdiqua et Ferdinand Ier devint empereur. Cependant, la paix d'Augsbourg ne s'appliquait pas au royaume de Bohême. A côté des églises autorisées, l'église catholique et l'église utraquiste, luthériens et Frères moraves étaient actifs, en dépit de leur présence illégale. L'Eglise catholique n'entendait pas renoncer à son influence en Europe. Au concile de Trente, elle se fixa pour objectif la recatholicisation et la reconquête de ses positions.
Pour la première fois depuis l'époque hussite, en 1561, l'archevêché de Prague fut de nouveau occupé , avec à sa tête, Brus de Mohelnice. Les luthériens, les utraquistes et les Frères moraves se mirent d'accord sur une foi unique appelée la Confession tchèque . Elle devait assurer la liberté religieuse et la gestion indépendante des églises non catholiques. En 1575, ils la présentèrent à Maximilien II (1564–1576). Le souverain, qui avait besoin de l'approbation du parlement pour prélever de nouveaux impôts et pour l'élection de son fils Rodolphe sur le trône de Bohême, n'avait guère de marge de manœuvre. Il approuva la Confession tchèque oralement, toutefois jamais par écrit.
En déplaçant la cour de Vienne à Prague, l'empereur Rodolphe II (1576–1611), rendit pour un temps à celle-ci l'importance et l'éclat d'une capitale. La Bohême devint le centre de l'empire. Rodolphe II est connu essentiellement comme mécène, collectionneur, amateur d'astronomie, d'alchimie et d'astrologie , mais aussi comme un original qui alternait les crises de fureur et des chutes dans une profonde apathie. L'empire de Rodolphe était menacé par les Turcs. Les magnats hongrois profitèrent de cette situation pour conclure avec eux des alliances contre les Habsbourg. Après l'une des défaites, les Hongrois réussirent à obtenir, par l'Accord de Vienne, une liberté religieuse et politique. Mais malgré sa défaite, Rodolphe refusa de signer l'accord et de reconnaître sa validité.
Ce fut en fin de compte Mathias, le frère de l'empereur, qui le signa. Rodolphe, malade, soupçonnait en permanence Mathias de vouloir usurper le trône, ce qui finalement arriva. En boycottant l'Accord de Vienne , Rodolphe avait fortement irrité Mathias, mais aussi les Etats hongrois, autrichiens et moraves. Ils se liguèrent tous contre lui en 1608. La représentation des Pays tchèques ne prit cependant pas position en faveur des rebelles et Mathias dut négocier avec son frère Rodolphe. II fut forcé de reconnaître la paix de Vienne et de laisser le pouvoir à Mathias en Hongrie, en Moravie et en Autriche. Il ne lui restait plus que la Bohême, la Haute et la Basse Lusace, et la Silésie. Les Pays tchèques profitèrent de cette faiblesse du souverain et brandirent la menace d'une révolte.
Rodolphe II préféra éditer, le 9 juillet 1609, la célèbre Lettre de majesté . Il y était déclaré que personne ne pouvait être forcé d'adopter la foi catholique ou toute autre religion . Il confirmait ainsi la Confession tchèque de 1575 incluant la noblesse, les villes royales et les sujets. Il garantissait la liberté religieuse indépendamment de la position sociale de l'individu. Trente défenseurs de la foi furent élus, dix pour chaque état : noblesse, chevaliers et villes. S'efforçant d'exclure de la succession son frère haï, Rodolphe tenta de renverser la situation. Il se servit du soutien de l'évêque de Passau, son parent, en laissant ses armées entrer en Bohême, ce qui provoqua bien entendu désapprobation et émeutes dans le pays. Il dut abdiquer du trône de Bohême, permettant ainsi à Mathias de prendre sa place (qui régna entre 1611et 1619).